Inleiding.
Het fotograferen van de ontwikkeling van salamander-, padden- en kikkerembryo’s gebeurt uiteraard bij ópvallend licht. We kunnen met eenvoudige apparatuur de boeiende embryologische ontwikkeling gadeslaan en fotograferen. Voor een betere scherptediepte kunnen de foto’s gestackt worden.
Het handboek van Alfred Huettner is bij embryologie een onmisbare bron van inspiratie en begrip (Ref.1).

Wat zien we?
In het ontwikkelingsproces van de zygote, de bevruchte eicel, tot het ‘uitsluipen’ van de larve, zijn de celdeling, het gastrulatie- en neurulatieproces en het roteren van het embryo het indrukwekkendst  en daarnaast ook de vorming van de uitwendige kieuwen en het kloppen van het hart.
De celdeling vindt beurtelings plaats langs de evenaar en de meridianen van de eicel, waarbij tot ongeveer het 64-cellig stadium alle cellen zich telkens synchroon delen (Foto 1).
Het gastrulatieproces vormt het maag-darmkanaal. De gepigmenteerde animale cellen aan de bovenzijde overgroeien de pigmentloze vegetatieve cellen aan de onderzijde, totdat daar de oermond, de latere anus, ontstaat (Foto 2). De eieren draaien met hun donkere kant naar de zon toe om zoveel mogelijk licht en warmte op te vangen voor een snelle groei. Omdat er in deze fase nog geen trilharen zijn, wordt wat ‘boven’ is gestuurd door de zwaartekracht en niet door lichtgevoeligheid (eigen waarneming).
Bij het neurulatieproces zien we hoe op de toekomstige rug van het embryo een neurale plaat ontstaat, die zich via een neurale groeve tot een neurale buis, de ruggenstreng, ontwikkelt (Foto 3).
Een paar dagen na de vorming van het ruggenwervelkanaal heeft het embryo kennelijk behoefte aan meer zuurstof, waarin voorzien wordt doordat het embryo gaat rondtollen in het eivlies, aangedreven door (voor ons onzichtbare) trilharen; ongeveer één omwenteling per minuut, een dag of drie lang (Foto 4). Daarna komt het gekromd klem te zitten, waardoor niet het embryo in het ei roteert, maar de celvloeistof rond het embryo stroomt (Foto 5).
Tussen de verschillende soorten amfibieën komen diverse kleine verschillen in ontwikkeling voor.
Een aantal soortspecifieke fotoseries van de ontwikkeling van ei tot volwassen dier is samen met een beknopte beschrijving te vinden op www.semperinmotus.nl (Ref. 6).

Wat hebben we nodig?
We hebben natuurlijk een camera nodig met een macrolens, een goede verlichting, een stacking programma voor op de computer en natuurlijk verse eieren. Voor veel, maar niet alle opstellingen is een microscoop met adapter nodig. En als laatste dienen we veel tijd te hebben, geduldig te zijn en de moed te hebben veel foto’s weg te gooien.

De meeste foto’s heb ik gemaakt met de nu gedateerde Nikon Coolpix 4500 die via een adapterlens HWF 10x18 is gekoppeld aan de wel zeer basale zoomloze Olympus microscoop type VB 601 (Foto 7). Toch is dat niet zo’n gekke keus. De 4500 heeft internal focusing en internal zoom, waardoor alle bewegingen ín de camera plaatsvinden. Door in te zoomen wordt vignettering vermeden en kunnen we mooi beeldvullend fotograferen. We stellen de camera in op manual, diafragma vol open en focus op oneindig; scherpstellen gebeurt met de microscoop. Er wordt hierbij gebruikgemaakt van het virtuele beeld dat de microscoop vormt. Het scherpstellen op het kleine LCD scherm is geen probleem omdat we toch een serie van ongeveer 15 beelden maken, van top tot teen, zodat alles wel een keer scherp in beeld komt.
Microscopen met zoominrichting geven in het algemeen beelden van een mindere kwaliteit dan die met een vaste optiek.
Bij stacken of stapelen wordt van elke foto van de serie het scherpe deel gebruikt om er één foto met grote scherptediepte van te maken. Combine ZP is een goed en gratis programma; een programma als Zerene Stacker geeft meer mogelijkheden maar is niet gratis.
Het is handig om op de focusknop van de microscoop een schaalverdeling en een handle te monteren zoals die op een kolomboormachine zit (Foto 6).

Inmiddels heb ik betere camera’s en microscopen, die veel meer mogelijkheden bieden, maar niet noodzakelijkerwijs tot betere foto’s leiden.
Veelal zullen we tegenwoordig met een spiegelreflexcamera body werken die middels een adapter met projectielens op een trinoculair microscoop is gemonteerd. Het microscoopobjectief vormt een reëel beeld ín de tubus. Om dit beeld op de camerasensor te kunnen projecteren, zouden we de 3e tubus kunnen afzagen; handiger is om een projectielens te nemen die het reële beeld omhoog tilt tot boven de tubus en op de camerasensor laat vallen.

Om trillingen te beperken, moeten we niet alleen een solide opstelling hebben, maar dient een spiegelreflex camera beslist Mirror Lock UP (MLU) te hebben en moet de spleetsluiter op ‘stil’ (electronic first shutter curtain) worden gezet. Zie daarvoor het overtuigend bewijs met de scheermestest van Charles Krebs (Ref.2).
Live View is erg handig om goed te kunnen scherpstellen.
Veel moderne systeemcamera’s, met verwisselbaar objectief maar zonder de hinderlijk klappende spiegel kunnen zeker ook met succes worden toegepast.

Voor het vastleggen van de eerste celdelingen zijn verse eieren een eerste vereiste, vooral bij warm weer. We kunnen ze in de natuur zoeken, van bevriende kwekers krijgen, maar het beste is een tuinvijver met ‘eigen’ dieren of amfibieën in een aquarium houden. De Mexicaanse Axolotl salamander is vanwege zijn gemakkelijke verzorging en de grootte van de eieren erg geschikt. Wanneer we na de embryologische ontwikkeling ook die van de larven tot volwassen dier willen volgen, stapelen we niet alleen de foto’s maar ook meerdere hobby’s op elkaar, waardoor het al snel uit de hand loopt.

We kunnen ook zonder aparte microscoop fotograferen, door van de camera een microscoop te maken en deze op een stevig statief te zetten.
Voor deze opstelling gebruik ik zelf een Leitz reprozuil met daarop gemonteerd het focus blok van een Olympus studentenmicroscoop (Foto 8). Daarmee kan ik de afstand van camera tot object  zeer grof, grof, fijn  en zeer fijn, tot in micrometers, instellen; ik heb dan de mogelijkheid van grof macro tot wat tegenwoordig ‘Extreme Macro’ heet (Ref. 5), tot een afbeeldingsmaatstaf van 1:10 of hoger.
Voor ‘normale’ macro opnamen gebruikt men een macrolens of een omgekeerde vergroterlens met een brandpuntafstand van liefst 50 mm. Een van de beste vergroterlenzen is de El Nikkor type N met F=2,8 te herkennen aan de kunststof behuizing en het diafragmagetal in een kadertje (de ‘N’ staat niet op de lens, alleen op het doosje). Om reflecties te vermijden moet een zonnekap worden gebruikt.
Bij Extreme Macro plaatst men op de camerabody een tubus met een lengte die 10 mm korter is dan de microscoop tubus met daarop een eindig microscoop-objectief of, voor een Full Frame camera, een 200 mm telelens met een oneindig objectief. Bij andere sensorformaten kan men een telelens met een kortere brandpuntsafstand kiezen. De objectieven moeten een werkafstand hebben die lang genoeg is voor ópvallend licht.

Voor de verlichting gebruikt men vaak de bekende Ikea LED lampjes met of zonder aparte reflectors, grijsfilters en koffiebekertjes. Toch kan een koudlichtbron met flexibele lichtgeleiders met daarop een lensje heel effectief zijn om plaatselijk strijklicht toe te voegen en daarmee de structuur van het object beter zichtbaar te maken.

Bedenkt dat er de wereld te koop is aan oude telelenzen, macrolenzen en ander optiek met verouderde draadsoorten, zoals P-draad. De meeste aanpassingsringen voor moderne camera’s zijn voor een habbekrats te koop (Ref. 3 en 4). Dat geeft ons de mogelijkheid om voor een paar tientjes kwalitatief goede lenzen te kopen en daarmee te experimenteren; dat kan nodig zijn omdat de resultaten meestal onvoorspelbaar zijn en niet alle combinaties scherpe foto’s geven.

Hoe gaan we te werk?
Allereerst zorgen we voor een stabiele opstelling; bij betonnen vloeren in de vorm van een stevige zware tafel, bij houten vloeren bevestigen we het tafelblad aan de muur.
Zoals gezegd fotograferen we bij compact camera’s met de lens vol open. Gebruiken we een camera body op een microscoop dan is er geen diafragma, net zomin als bij Extreme Macro. Met een macrolens of omgekeerde vergroterlens kunnen we een paar stappen diafragmeren om de scherptediepte te verhogen, zeker als we niet stacken.
Een goede belichting is cruciaal; alleen beelden die op het scherm perfect lijken, kunnen goede foto’s opleveren.

De cuvetten, Petrischalen en andere bakjes waarin we de objecten plaatsen om te fotograferen mogen beslist niet te klein zijn, omdat het materiaal dan zeker dood zal gaan als gevolg van zuurstofgebrek; 15 ml lijkt mij het absolute minimum voor een enkel ei. Wanneer we de mogelijkheid willen hebben om een opname over te maken (de ontwikkeling van het embryo gaat door!) bewaren we wat eieren in de koelkast, waardoor de ontwikkeling wordt vertraagd. Ruwweg geeft elke 10º C temperatuurdaling een halvering van de resterende ontwikkelingstijd. Dit kan alleen bij inheemse soorten; axolotls overleven dit niet.
Kies de schoonste eieren; rond het eicelmembraan zit een flinke klodder gelei waar alles aan vast plakt. Een ei op een blaadje van een waterplant geeft een mooie natuurlijke uitstraling en maskeert stofjes en vuiltjes.
Gebruik geen vers kraanwater om het ontstaan van luchtbelletjes te voorkomen.

Er zijn methoden om het optimale aantal beelden in een stack van een bepaalde diepte te berekenen, maar met wat gevoel krijgen we prima resultaten. Te weinig beelden geeft onvoldoende scherpte, te veel kan allerlei artefacten geven, zeker bij een stereomicroscoop van het Greenough principe, waarbij het beeld ‘wandelt’ bij verleggen van de focus, dit in tegenstelling tot microscopen volgens het Parallel-optics of Common Main Objective (CMO) principe (Ref.7).
In de rotatiefase is het onmogelijk om een geslaagde fotostack te maken. Wel kunnen we filmen in hoge resolutie en uit de film stills knippen en die stacken. We bewegen dan bij het filmen de ‘kolomboor handle’ naar beneden om glijdend de focus te verleggen. Het blijkt niet nodig te zijn om voor het nemen van elke foto deze beweging te stoppen; bij een eenparige beweging krijgen we stills van voldoende kwaliteit.
Als alternatief kan men een bedwelmend middel toedienen, zoals MS222 of chloraal hydraat. Daarmee heb ik bij kikkervisjes de kieuwademhaling kunnen stoppen terwijl het hart bleef kloppen, zodat ik de liptandrijen, die bij de bruine kikker anders zijn dan bij de heikikker, voor determinatiedoeleinden heb kunnen fotograferen. In schoon water zwommen de dieren later weer vrolijk weg.

Doorgaan voor gevorderden.
Geïnspireerd door eerst de ideeën van André Wieringa en later de resultaten van Jan van IJken, ben ik ook gaan time lapsen. Daarbij komen we voor meer en grotere problemen te staan dan bij stackfotografie, zoals het groeien en de verschuiving van het object, verdamping en bijvullen van water, tussentijds scherpstellen, zuurstofgebrek, algengroei, vervuiling, kaamvorming en tijdsdruk door het langdurig bezet zijn van de apparatuur. En willen we een film maken die is samengesteld uit foto’s, video’s en time lapses dan worden we geconfronteerd met verschillende formaten, bij film 4:3 of 16:9 en bij camera’s 3:2, 4:3 of vierkant. Dit is slechts een willekeurige selectie uit de grote veelheid van uitdagingen die ons toelachen.
Een deel van de problemen kan worden voorkomen of opgelost door Live View (en dus ook MLU) gelijktijdig met Time Lapse toe te passen, wat voor Canon mogelijk wordt gemaakt door het programma Breeze; EOS Utilities heeft deze optie niet.
Jan van IJken, André Wieringa en ik delen alle problemen en mogelijke oplossingen. Alleen door samenwerking en het delen van informatie kunnen we vooruitgang boeken en is het geheel meer dan de som der delen.
Ik zou willen zeggen: Zwaan kleef aan.

Referenties:
1. Fundamentals of comparative embryology of the vertebrates by Alfred F. Huettner voor meesterlijke tekeningen met een duidelijke beschrijving van de fasen in de  embryologische ontwikkeling.
2. http://krebsmicro.com/Canon_EFSC/index.html voor de scheermestest van Charles Krebs.
3. http://camerapix.co.uk voor betaalbare camera-adapters en draadringen, met een korte levertijd.
4. https://nl.aliexpress.com/  voor goedkope camera-adapters en draadringen, tegen een lage prijs en een langere levertijd. 
5. http://extreme-macro.co.uk/ voor een modulair opgebouwde professionele en volledige serie over Extreme Macro.
6. www.semperinmotus.nl  voor een aantal soortspecifieke  fotoseries van de ontwikkeling van ei tot volwassen dier, met een beknopte beschrijving van de embryologische stadia. 
7. http://www.jaso.fi/mikrosko/nikon_stereoscopic_microscopes_optical_systems.pdf voor de uitleg van het Greenough-  en het Parallel-optics of Common Main Objective (CMO) principe.

Ben Geutskens
This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

www.semperinmotus.nl




1. Celdeling, 8-cellig stadium met chocoladebruine animale- en lichtgekleurde vegetatieve cellen bij de blastula van de groene kikker.


2. Einde van het gastrulatieproces bij de knoflookpad. De vorming van de ongepigmenteerde oermond, ‘yolkplug’, is duidelijk te zien.


3. Neurulatie bij het embryo van de groene kikker. De neurale groeve is bijna gesloten.


4. Het op de gebruikelijke wijze een geslaagde fotostack maken in de rotatiefase is ondoenlijk; een time lapse video zou hier uitkomst bieden.


5. Embryo van de kamsalamander, vastgeklemd in het ei.


6. Kolomboor handle met schaalverdeling op een stereomicroscoop.


7. Nikon Coolpix 4500, gemonteerd op een Olympus stereomicroscoop.


8. Reprozuil met focus blok en Canon EOS 40D, voor een universele toepassing.